说起中国当前最炽手可热的科学家，大家脑海里第一个跳出来的名字十有八九是韩春雨，除却研究的重大意义，韩春雨研究环境的简单、经费紧张已成为大家津津乐道的励志典范。但近日，方舟子公开发文对韩春雨的“诺奖级”论文的“实验的可重复性”。
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以下为方舟子《河北科技大学韩春雨“诺贝尔奖级”实验的重复性问题》的部分节选：
这几天我陆续收到几家实验室的研究人员的来信，反映重复不出韩春雨论文中最关键的图4结果（切割基因组，T7E1和测序），呼吁我关注一下这事。
有些人已在网上生物专业论坛公开讨论此事，报告他们没法重复该实验，询问有谁重复出来了。目前还未见有人反映重复出了图4结果。有的能够重复论文中的图3结果（FACS和Western Blot），但那有可能是假阳性。
据听报告的人说，韩春雨在北大和遗传所的报告上都强调，他目前的NgAgo是初级版、需要高超的实验技巧、等他推出2.0版和Smart版。这些说法跟他在论文里的描述是矛盾的。因为他描述的只是个并不复杂的转染实验，T7E1和测序也都是现成的技术，并不需要高超的实验技巧，按照其提供的步骤应该是不难被重复出来的。
……
我当然不怕被人肉，也不怕挨骂，所以在此问几个问题：
第一，有没有人重复出了韩春雨论文中的图4结果？有的话跟我说一下。
第二，据称韩春雨在遗传所的报告上说，重复出来和不能重复的比例是1：3，能重复出来的有20家。那么究竟有哪家实验室重复出来了？（指图4结果）这事没必要保密吧。
第三，韩春雨说做这个实验“需要高超的实验技巧”，那么究竟在哪个步骤需要什么样的高超实验技巧？
为什么一个新实验的结果别人都反映重复不出来，原因很多，比如可能是重复出来的都不吭声，重复不出来的实验技术不行，论文中隐瞒了关键的“实验技巧”（这不道德），或者论文报告的结果干脆就是编的（这更不道德）。一个新的科学发现、技术，需要经过别人的重复才得到公认。别人重复不出来，有疑问，是很正常的。
作为首创者应该做的是去消除疑问，而不是攻击、谩骂，否则那更让人怀疑。
重复性=真实性？
方舟子的质疑在网上一石激起千层浪，一些激进的人甚至直接提起了小保方晴子，声称：不能重复，真实性就不能保证！
的确，实验重现性一直是科学家们追求的目标，通常认为只有高重复率的实验才代表着真是的数据，但把重复性直接等同于真实性，答案还有待考证。Science期刊上的《Estimating the reproducibility of psychological science》通讯作者Brian Nosek关于此提出了他的论点。
他首先提到，研究者需要知道有些因素会导致”文章灌水”，以至于实验不可重复。一般的”文章灌水”有三种原因，第一是有倾向性地发表支持猜想的数据，第二是只发表有显着统计学意义的数据，第三是研究样本数量不够。这篇发表在《Science》上的研究，还给出了其他原因，即实验样品的差异、实验设定的差异以及实验完成的质量差异等等。
正如世界上没有完全相同的两片树叶一样，实验室样品也不能说完全一样，再加之每个实验室的设备质量、实际使用情况不一，实验室操作人员熟练程度的参差不齐，人员流动过大等等。比如弗吉尼亚大学研究平滑肌细胞的博士后Laura Shankman曾表示，如何整合各种方法本身就是一个项目，在短短一段时间里，数个博士后和研究生离开了她所在的实验室，而留下的人很难确保实验的一致性。所以客观上存在很多影响实验重现性的不可控因素。
然而，对于Brian Nosek等给出的这三种原因（实验样品的差异、实验设定的差异以及实验完成的质量差异），也有人并不十分认同前两者。对于实验完成的质量的问题，也可能存在这样的情况，即重复实验在数据上和原始实验存在显着性差异，很可能是重复实验时候没有处理好或者操作正确。所以，实验重现性不能作为检验实验假说的唯一标准， 但同时，我们也不能忽视实验重现性的作用，我们需要谨慎把握实验真实性和重现率的平衡。
方舟子的质疑
有人能重复（FACS和Western Blot），但那有可能是假阳性。
在图片3中，研究人员在哺乳动物细胞中比较了NgAgo-gDNA系统和Cas9-sgRNA系统的编辑效率，发现NgAgo-gDNA系统让靶基因失活的效率与Cas9-sgRNA系统一样高。利用这种方法，他们还证实对NgAgo而言，单链gDNA的最佳长度是24个核苷酸左右。
目前还未见有人反映重复出了图4结果。
图片4中，设计了针对人DYRK1A基因的gDNAs，以及另外的八个不同基因的47条guides，效果均不错，作者还在乳腺癌细胞系MCF-7、人骨髓细胞系K562和HeLa细胞系在内的多种哺乳动物细胞系中测试了NgAgo-gDNA系统，结果发现在所有这些细胞系中，NgAgo都能够高效地诱导DYRK1A基因靶位点发生双链断裂，证明了其广泛的基因组靶向范围。
同时，作者也设计实验证明NgAgo介导的靶DNA切割对这个gDNA每个位置上的单核苷酸错配非常敏感：切割效率下降了73%～100%，其中P8～P11位置上发生的单核苷酸错配导致最大的切割效率下降（85%~100%），他们还发现任何3个连续位置发生错配会完全破坏这种切割，这些实验初步地证实NgAgo-gDNA系统是高度保真的。
对于方舟子的质疑，韩春雨是这样回答的
早前，韩春雨一经报道，就有细心的人在贴吧上找出了韩老师（邮箱已暴露了身份）。
而此次韩春雨老师的回复是其在“国际米兰吧”上的回帖。网友“第十三米的阳光”引用方舟子的文章《河北科技大学韩春雨“诺贝尔奖级”实验的重复性问题》中的内容在该贴吧内发帖。（http://tieba.baidu.com/p/4645810480?pid=93027569268&cid=0&from=prin#93027569268）↓↓↓
韩春雨老师用自己的“槐北路“的账号进行了回复↓↓↓
对于方舟子和网友们提出的质疑，韩春雨在该回复里进行了详解解答↓↓↓
有人能重复（FACS和Western Blot），但那有可能是假阳性。
韩春雨的回复：细胞做好检测，不要有寄生菌污染，不要有支原体污染（Ago系统对污染特别敏感——特别是单转guide假阳性——我非常确定在没有污染的情况下，单转guid不会影响GFP表达，假阴性也大多因为细胞污染，假阳性和假阴性我都遇到过，国内买的细胞我就不吐槽了），转染用的质粒质量要好（可用30ngGFP转细胞，若是均一且效率高表明质量好，强弱不均一则表明质量差，越不均一表明质量越差），guide磷酸化完全（没有磷酸化不能load和切割——谢谢印证我的Fig2结果，至于怎么检测，自己跑个PAGE看看……）。
目前还未见有人反映重复出了图4结果。
韩春雨的回复：Fig4，也是几乎惟一算是有难度的，就是控制转染时的细胞密度和用血清控制细胞生长，时间稍长，毕竟NgAgo未经过系统的密码子优化——照着online method上protocol for genome editing and T7E1做（小经验，PCR最好不要有引物二聚体，如果引物二聚体多请重设引物；PCR产物直接回收最好不跑胶回收，可能跟ago切24bp有关，设好对照！）银染分辨率高，可以排除T7E1假阳性，能做出预期条带后请用PCR产物去测序。欢迎大家广泛使用此系统，并分享成功经验和失败教训。附，addgen上的质粒，可以直接用作基因组编辑。再次强调，不加NgAgo，就能抑制GFP，是假阳性，是细胞出问题了（谢天谢地不但我自己而且审稿人也有这个对照）出现假阳性的细胞切基因组就没戏了。对于Fig4，若是不习惯做银染，也可以直接做KI：doner 用GFPcoden+polyA signal，前后加几个保护性的碱基——从GFP-N1扩出来连到T-vector上，再从此doner-Tvector上扩（防止GFP-N1污染的假阳性）出来纯化，500-800ng共转（for each well of 24 well plate）。
对于韩春雨的回复，方舟子进一步质疑
那么这种“高超的实验技术“究竟是不是实验细节的处理，不同网友也有自己的看法，有网友表示pcr已经有那么久的历史，且机器已经半自动化，但目前也不是每个人次次都能成功。在实验过程中，技术不难，难的是整个实验过程都不能有半点差错。关键一步都没处理好，所以做不出来，但是恰恰是关键的一步 这也是他能做出来成果，别人做不出的原因。
韩春雨也强调了无污染细胞的重要性
而对于目前大家较为关注的重复性问题，目前网上虽然有一些表示没有重复出来，一方面韩春雨老师经过几年发表出来的结果，而目前大部分实验室也只刚刚尝试几个月，另一方面一些网友认为目前重复不出来的原因也可能是在这个风口浪尖，为避免惹祸上身，重复出来的人也未必想站出来发声。而且也有网友爆料来自印度的学者Dr. Debojyoti Chakraborty发言已重复出韩春雨NgAgo实验。
Hi guys，
We have used this system and it works. We have followed the same protocol as mentioned in the paper and were able to confirm knockout both on FACS as well as western. We purified the oligos on gel after T4 PNK and saw the phenotype after 48 and 72 h.
cheers
debo
并且详细分享了他们的protocol：
Here’s the protocol we followed：
We first phosphorylated the gDNA using the PNK kit from Ambion for 1 hr followed by heat inactivation at 95 degrees for 5 min. We then went on to transfect 100，000 cells in 12 well plates as follows：Mix 1：
Lipo reagent- 3ul
Optimem- 43ul
EGFP N1- 1 ug
NgAgo- 900 ng
gDNA- 500 ngMix 2：
Lipo 3000- 2ul
Optimem- 48ulMix 3：
Media- 250ul
Optimem- 150ulMix1 and Mix2 was incubated for 10min each and then both were mixed together and incubated at RT for 30min
This was now added to cells. To each well， 50 ul of Mix 3 was added on top. No further media was added to the cells.
After 12h， the mix was removed and fresh media was added.
科研成果的权威性是在质疑声中建立起来的，而影响力越深远、意义越重大的成果，受到的质疑就越多。最前沿领域的科研成果的鉴别通常异常困难，难以证明，也难以证伪。而检验一项新技术需要时间和客观标准，实验肯定有关键细节，韩春雨本人也不回避系统的不稳定性，也表示希望与同行进行交流，且目前在努力改进，即将推出2.0版和smart版，让我们拭目以待吧。
来源：生物谷。
